《Cell Host & Microbe》：Cryptosporidium modifies intestinal microvilli through an exported virulence factor
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这篇研究聚焦隐孢子虫（Cryptosporidium）。它是威胁公共健康的肠道寄生虫，能引发儿童严重腹泻。研究发现其通过分泌微绒毛蛋白 1（MVP1）等毒力因子，与宿主 EBP50 和 CDC42 相互作用，影响微绒毛伸长，且与细菌毒力因子 MAP 机制相似，为防治提供新思路。
隐孢子虫研究背景
隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种常见的肠道寄生虫，通过粪 - 口途径传播，感染常由水源引起，其卵囊对常规水处理方法有抗性。在全球范围内，儿童 5 岁以下约 9% 的死亡率归因于腹泻疾病，隐孢子虫是导致儿童严重腹泻的主要原因之一，不仅会导致死亡，还会引发营养不良，进而对儿童认知发展和生长发育产生永久性影响，而营养不良又会加重隐孢子虫感染。
当隐孢子虫卵囊被摄入后，会在环境因素刺激下释放子孢子，子孢子侵入并在宿主肠道上皮细胞内复制。隐孢子虫虽为细胞内寄生虫，但处于宿主细胞质外的寄生泡中。经过无性繁殖（裂殖生殖）和有性繁殖阶段，最终产生新的感染性卵囊排出体外。
与其他 Apicomplexa 家族寄生虫（如弓形虫 Toxoplasma 和疟原虫 Plasmodium）类似，隐孢子虫可能通过向宿主细胞输出效应蛋白来生存和繁殖。然而，此前对隐孢子虫的宿主输出因子了解甚少，且其感染导致宿主细胞肌动蛋白细胞骨架重塑的机制也不清楚，其中感染时宿主细胞微绒毛长度的变化是一个显著现象。
研究发现隐孢子虫相关蛋白及功能
为了确定隐孢子虫潜在的宿主输出蛋白，研究人员通过生物信息学方法，利用公开的基因组和转录组数据集筛选出基因 cgd6_40。该基因满足存在预测的 N 端信号肽、高非同义与同义比（dN/dS > 2）以及感染早期高 RNA 表达等条件。
研究人员利用 CRISPR - Cas9 技术对 cgd6_40 进行标记，发现其编码的蛋白在子孢子阶段定位于寄生虫的小颗粒（一种分泌细胞器）和棒状体，感染宿主细胞后，该蛋白在感染早期被输出到宿主细胞，并在整个寄生虫生命周期中持续存在。通过一系列实验，证实该蛋白依赖内质网到高尔基体的运输途径进入宿主细胞，并定位于宿主细胞微绒毛的顶端膜，因此将其命名为微绒毛蛋白 1（MVP1）。
进一步研究发现，MVP1 进入宿主细胞依赖一个保守的氨基酸基序，其中苯丙氨酸（F39）至关重要，突变该位点会阻断其进入宿主细胞。在隐孢子虫基因组中，存在一些与 MVP1 组成相似的小的非结构化蛋白，它们也含有预测的信号肽、类似的输出基序和 C 端丝氨酸重复序列，这些蛋白大多定位于染色体 2 的特定区域，且部分蛋白能输出并定位于宿主微绒毛，共同构成了 MVP 蛋白家族。
MVP1 对寄生虫毒力及宿主细胞的影响
在 MVP 家族中，MVP1 在寄生虫复制过程中表达量最高。研究人员构建了 MVP1 基因敲除（KO）的寄生虫株，发现感染 MVP1 - KO 寄生虫的小鼠体内寄生虫脱落量约为感染 MVP1 - HA 寄生虫小鼠的一半，然而在体外培养的肠道上皮细胞中，两者生长无显著差异，这表明 MVP1 在体内影响寄生虫的适应性。
通过对感染细胞的成像分析发现，缺失 MVP1 会阻断感染上皮细胞中微绒毛的伸长，野生型和 MVP1 - HA 感染的细胞微绒毛明显伸长，而 MVP1 - KO 感染的细胞微绒毛长度与未感染细胞相当，扫描电子显微镜结果更直观地显示了这种差异。
MVP1 与宿主蛋白的相互作用机制
为探究 MVP1 影响宿主细胞微绒毛的机制，研究人员通过酵母双杂交筛选发现 MVP1 与宿主支架蛋白 EBP50（也称为 NHERF1）存在显著相互作用，且 MVP1 与 EBP50 的 N 端 PDZ1 结构域结合最强，这一结果在感染 MVP1 - HA 寄生虫的上皮细胞共定位实验中得到验证。
已知 EBP50 参与维持上皮细胞顶端表面微绒毛，同时也是细菌效应蛋白（如肠致病性大肠杆菌 EPEC 的毒力因子 MAP）的作用靶点。MAP 通过 C 端的 “TRL” 基序与 EBP50 的 N 端 PDZ 结构域结合，激活 CDC42，从而驱动微绒毛伸长。隐孢子虫 MVP1 具有类似的 C 端 “TKL” 结构域，也能与 EBP50 结合，当 MVP1 的 TKL 结构域被截断时，与 EBP50 的相互作用丧失，且感染细胞的微绒毛伸长显著减少，而添加 EPEC MAP 的 C 端 8 个氨基酸可挽救这一表型。
此外，虽然 MVP1 没有可识别的 GEF 结构域，但含有与 Cdc42 和 Rac 相互作用的 CRIB 结构域，通过计算机结构建模和实验验证，发现 MVP1 与 CDC42 存在相互作用，去除 CRIB 结构域会完全阻断隐孢子虫感染上皮细胞的微绒毛伸长，且该效应与宿主输出无关。这些结果表明，MVP1 与 MAP 通过类似机制，即与宿主 EBP50 和 CDC42 相互作用，驱动感染上皮细胞微绒毛伸长。
研究意义与展望
本研究首次鉴定了隐孢子虫的 MVP 蛋白家族，它们具有保守特征并定位于感染宿主上皮细胞的微绒毛。MVP1 作为该家族的重要成员，在寄生虫感染过程中发挥关键作用，其通过与宿主蛋白相互作用影响微绒毛伸长，这一机制与细菌毒力因子 MAP 相似，体现了真核和原核病原体在调节宿主肌动蛋白结构方面的趋同进化。
然而，仍有许多问题有待解决。例如，小颗粒在感染中的具体作用机制，MVP 家族其他成员的功能，以及微绒毛伸长在隐孢子虫感染中的生理意义。MVP1 与 EBP50 的相互作用可能是隐孢子虫病腹泻症状的潜在机制之一，未来对这一相互作用的深入研究可能为防治隐孢子虫感染提供新的靶点和策略。
