在肿瘤的战场上，癌细胞就像一群狡猾的敌人，它们通过表达抑制性配体，躲避免疫系统的攻击，在体内肆意生长。近年来，免疫检查点（IC）疗法成为对抗癌症的有力武器，其中免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现，显著改善了多种癌症的治疗效果，甚至因此获得了诺贝尔医学奖。然而，ICIs 在使用过程中面临一些挑战，比如需要维持足够的抑制剂浓度才能发挥作用，而且它们依赖于细胞内特定的降解过程，难以广泛应用于所有细胞类型。此外，免疫检查点蛋白通常需要进行翻译后修饰（PTMs），其中 N - 糖基化修饰在细胞表面的免疫检查点蛋白中广泛存在，对蛋白质的稳定性、细胞间通讯、肿瘤发生和免疫反应等过程有着重要影响。大约 80% 的细胞表面蛋白会进行 N - 糖基化修饰，肿瘤细胞的异常糖基化会干扰免疫细胞的识别，削弱免疫细胞的抗肿瘤能力。所以，开发一种能够特异性去除免疫检查点蛋白 N - 糖基化修饰的技术，成为攻克癌症治疗难题的关键。

在此背景下，来自同济大学医学院附属第十人民医院、中国科学院上海有机化学研究所、复旦大学等机构的研究人员开展了相关研究。他们开发了一种名为 N - 糖基化靶向嵌合体（DGlyTAC）的技术，该技术将肽 - N - 糖苷酶 F（PNGF）与靶蛋白特异性的纳米抗体 / 亲和体（Nb/Af）融合，能够特异性地去除细胞表面靶蛋白的 N - 糖链，使免疫检查点蛋白失活。研究结果显示，DGlyTAC 技术对多种免疫检查点蛋白，如 CD24、CD47 和 PD-L1 等具有显著作用，能够有效阻断它们与配体的相互作用，增强巨噬细胞的吞噬作用，激活 T 细胞的免疫功能，从而抑制肿瘤生长。而且，该技术在体内实验中表现出良好的抗肿瘤效果，比传统的免疫检查点抑制剂更具潜力，为癌症免疫治疗提供了一种全新的策略。这一研究成果发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志上，为肿瘤免疫治疗领域带来了新的希望。

研究人员为开展这项研究，主要运用了以下关键技术方法：一是细胞培养技术，培养多种人源和小鼠源癌细胞系及相关细胞；二是蛋白质相关技术，包括蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测蛋白表达和糖基化水平、免疫沉淀（IP）研究糖基化与靶蛋白的相互作用；三是动物实验技术，构建小鼠肿瘤模型评估抗肿瘤疗效；四是质谱技术，通过 LC-MS/MS 分析糖肽。

下面来看具体的研究结果：

1. DGlyTAC 特异性去除 eGFP-CD24 的 N - 糖链：研究人员将 eGFP-CD24 质粒转染到缺乏 CD24 表达的 CHO 细胞中，用 PNGF 处理后发现几乎所有 N - 连接的糖链被去除。为提高特异性，构建了 DGlyTAC（nbGFP-PNGF），结果显示 5nM 的 nbGFP-PNGF 就能完全实现 eGFP-CD24 的去 N - 糖基化，而 500nM 的 PNGF 却无法达到相同效果。这表明 nbGFP-PNGF 能选择性去除 eGFP-CD24 的 N - 糖链，且对整体 N - 糖基化水平影响极小。

2. DGlyTAC 调节巨噬细胞功能：研究发现，CD24 去 N - 糖基化后与 Siglec-10 的结合能力大幅下降，巨噬细胞对表达 CD24 细胞的吞噬作用显著增强。同时，针对 CD47 开发的 DGlyTAC（nbCD47-PNGF）也能部分去除癌细胞中 CD47 的 N - 糖链，增强巨噬细胞对癌细胞的吞噬作用。这说明 N - 糖基化在 CD24 与 Siglec-10、CD47 与 SIRPα 的相互作用中起着关键作用，DGlyTAC 可通过调节这些相互作用来增强巨噬细胞的功能。

3. DGlyTAC 扩展靶蛋白范围：研究人员将 DGlyTAC 技术应用于生长因子受体，如 IGF1R、EGFR 和 HER2。结果显示，afIGF1R-PNGF、afEGFR-PNGF 和 afHER2-PNGF 能分别使相应受体的蛋白条带向较小分子量迁移，表明它们能去除受体的 N - 糖链。虽然对于 EGFR 和 HER2，DGlyTACs 不能完全使其去 N - 糖基化，但这一结果表明该技术可应用于多种靶蛋白，为研究糖基化在生长因子受体中的作用提供了新方法。

4. DGlyTAC 阻断 PD-L1 与 PD-1 的结合：PD-L1 的 N - 糖基化对其与 PD-1 的相互作用至关重要。研究人员利用 DGlyTAC（nbhPDL1-PNGF 和 nbmPDL1-PNGF）处理细胞后，PD-L1 的分子量显著降低，几乎所有 N - 糖链被去除，且能有效阻断 PD-L1 与 PD-1 的结合，同时不影响 PD-L1 的细胞膜稳定性和表达率。这表明 DGlyTAC 可作为一种 PD-L1 特异性糖苷酶，有效消除 PD-L1 与 PD-1 的相互作用。

5. DGlyTAC 的体内抗肿瘤作用：在多种小鼠肿瘤模型中，如 E0771、4T1 和 MC38 肿瘤模型，给予 DGlyTAC（nbmPDL1-PNGF）治疗后，肿瘤生长明显受到抑制，且该治疗效果优于 PNGF 和抑制剂对照。同时，nbmPDL1-PNGF 能促进肿瘤内免疫细胞的浸润，增强 T 细胞的免疫功能，且未引起明显的体重变化和器官毒性。此外，与已上市的 PD-1 抑制剂相比，nbhPDL1-PNGF 在增强 T 细胞的细胞毒性方面表现更优。

6. DGlyTAC 的体内分布和安全性评估：通过 IVIS 成像系统检测发现，DGlyTAC（nbmPDL1-PNGF）在肿瘤组织中高度富集，且在肿瘤组织中的去 N - 糖基化效率最高。H&E 和 TUNEL 染色结果显示，nbmPDL1-PNGF 对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等组织无明显毒性，其在体内的分布和去 N - 糖基化特性表明它具有良好的肿瘤靶向性和较低的潜在毒性。

研究结论表明，DGlyTAC 技术为酶工程提供了一种通用策略，可特异性去除活细胞表面糖蛋白的 N - 糖链，实现膜蛋白的靶向失活。与其他靶向蛋白降解策略（如 PROTACs 和 LYTACs）相比，DGlyTACs 具有独特的优势，它不依赖于降解相关蛋白，作用迅速且效果持久，能在较低浓度下发挥作用。与之前开发的抗体 - 唾液酸酶结合物相比，DGlyTACs 具有不同的药物靶点、作用机制和优势。然而，由于并非所有 N - 糖基化修饰都具有明确的生物学功能，在将 DGlyTACs 应用于一系列靶蛋白和临床试验之前，还需要对 N - 糖基化的功能进行更深入的研究。但总体而言，DGlyTAC 技术为研究 N - 糖基化在细胞生物学功能和肿瘤免疫治疗中的作用提供了有力工具，有望开创糖生物学和以糖蛋白为药物靶点的新时代，为癌症免疫治疗带来新的突破和希望。